感染预实验流程

本文以24孔培养板为例，介绍目的细胞和工具细胞的感染预实验。工具细胞可选用人胚肾上皮细胞293T或人肺癌细胞H1299，实验所需材料包括培养基、24孔培养板、移液枪及其枪头、EP管、细胞计数板、冰盒以及废液缸等。根据目的细胞的特性，可以考虑使用Polybrene以提高感染效率。

实验步骤

Day 1: 准备细胞

将细胞培养至对数生长期，使用胰酶消化并计数。以5×10⁴个细胞为每孔接种量，加入500µL的细胞培养液。通常情况下，H1299或293T细胞在感染后第3天可达到80%-90%的融合度。请根据实际细胞生长速度相应调整接种细胞数量，以确保目的细胞在第3天达到理想的融合度。

Day 2: 准备慢病毒颗粒并感染细胞

(1) 首先计算所需的慢病毒颗粒量，从-80℃的冰箱取出并在冰浴中融化。
(2) 观察培养箱内细胞的生长状态，确保细胞状态良好后，进行实验：
  A. 用移液枪小心吸去24孔培养板中的旧培养液，加入新的完全培养液；
  B. 在每个孔中加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平放在工作台上，以划8字的方式轻轻混匀；
  C. 混匀后，将细胞培养板置于37℃、5% CO₂的培养箱中过夜培养。

Day 3: 更换培养液

在感染12-16小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新加入含5%灭活FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。根据不同的目的细胞，感染时长可能需要调整，部分细胞不宜感染超过12小时。

Day 4: 观察细胞状态

持续培养细胞，并仔细观察其状态是否出现异常情况。

Day 5: 评估感染效率

盖紧24孔培养板，使用70%乙醇对培养板外壁进行清理，随后在倒置荧光显微镜下观察荧光情况，拍照并评估慢病毒颗粒的感染效率。如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需时间较长，建议在72或96小时后再观察荧光表达情况。根据观察到的荧光表现，可以通过MOI梯度实验初步确定目的细胞的最佳MOI值。

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