糖蛋白在人体蛋白质中占据超过50%的比例，并且是大多数生物制药的核心成分。蛋白质的糖基化作为一种重要且复杂的翻译后修饰（PTM），在调控多种生物过程方面起着至关重要的作用。糖蛋白一级序列的全面分析，包括糖基化位点的识别和相关聚糖结构的探讨，是深入了解糖蛋白功能的关键。

液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已经成为识别蛋白质和发现翻译后修饰的重要工具。与传统的数据库搜索策略不同，蛋白质的从头测序策略不需要预先了解DNA或氨基酸序列，这为糖蛋白质组学的研究开辟了新方向。然而，多糖基化位点的复杂性通常会导致序列覆盖不全和游离寡糖修饰谱的不明确，这使得获取信息丰富的糖肽碎裂谱以支持从头测序变得困难。在这一背景下，广泛的糖基化可能会导致某些区域出现序列空白，从而限制从头测序在具有一致结构和已知N-糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的有效应用。

2025年，JACSAu（IF86）上发表的“Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy”一文提出了一种基于质谱的糖蛋白识别方法，特点是结合了糖基释放介导的从头测序与糖基化位点的表征。作者通过N-/O-糖的去糖基化实现了全面的序列覆盖，并且结合了EThcD碎裂技术，以鉴定出高质量的长肽，从而促进了准确的蛋白质组装。

该方法在分析复杂的糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种未知序列的肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序中展现了良好的性能，揭示了一级序列的细微差异。同时，在亚基、糖肽和聚糖层面对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了表征，弥合了从头测序与糖基化修饰之间的鸿沟，为糖蛋白的一级结构与糖基化修饰提供了详尽的信息。

在研究方法方面，首先通过N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-聚糖，同时使用内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶以确保去糖基化的效果。接着，通过完整的质量分析确认去糖基化的效果，并运用电子转移高能碰撞解离（EThcD）碎裂技术获取高质量的肽段，并采用PEAKS AB分析其序列。同时，在含18O的环境中使用PNGase F酶解，将糖基化的Asn转化为Asp并标记18O，进行定量分析。此外，采用内切糖苷酶混合物C（EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本，进一步分析带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，以验证N-糖基化位点的鉴定结果。

该研究的结果展示了一种基于综合质谱法的从头解码蛋白质糖基化的新方法，采用了常用模型糖蛋白Fetuin-A（UniProt Accession no P12763）进行方法开发。通过糖苷酶水解糖苷键简化质谱分析，同时获得去糖基化蛋白的一级序列，并通过应用高度复杂的生物制药依那西普验证了该方法的性能。

接下来，研究者们将此方法应用于三种未知的TNFR:Fc生物制剂，发现了与依那西普的氨基酸序列之间的细微差异。不同的N-/O糖基化位点的全面表征揭示了糖基化的复杂性及其对蛋白质功能的影响。此外，研究还表明，依那西普和三种TNFR:Fc融合生物制剂在氨基酸位点上的结构差异可能影响其生物活性。

总结来看，基于质谱的从头测序方法为揭示氨基酸序列提供了强有力的工具，结合糖苷酶酶解与EThcD碎裂，有效提高了糖蛋白测序的准确性与糖基化特征的表征。这一新策略不仅为深入理解高度糖基化蛋白质的功能提供了新视角，而且为生物制药领域的研究与应用奠定了基础。尤其是对于主要通过CHO细胞系表达的糖蛋白治疗剂，尊龙凯时助力实现更精准的糖基化分析，从而提升临床治疗效果。