细胞复苏的成败与冻存和复苏的操作密切相关。上周，我和大家分享了关于细胞冻存时常见错误的细节，具体内容可以参考《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇文章将从复苏的角度进行分析，以梳理复苏过程中可能出现的问题。

复苏步骤回顾

在讨论常见错误之前，首先复习一下细胞复苏的具体步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，同时对培养基进行复温，并设定离心机的转速。
2. 准备一个15ml离心管并加入适量的培养基。
3. 取出冻存管，迅速将其浸入水浴锅中并摇晃，使细胞在2分钟内充分融化。
4. 将细胞悬液缓慢滴入提前添加了培养基的离心管中，进行1000rpm的离心3分钟。
5. 弃去上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，然后放入培养箱。

复苏过程中常见的错误操作

以下是细胞复苏时常见的错误操作：

1. 如果液氮或冰箱距离水浴锅较远，运输过程中未采取保冷措施，细胞可能在运输过程中开始融化（尤其在夏季）。冻存细胞应放置在干冰或冰盒上，确保及时送到水浴锅。
2. 在运输冻存管时，避免用手触碰到细胞部分或将其放入口袋中。应捏住管盖或使用容器运输，以防局部温度升高，导致细胞开始融化。
3. 采用错误的方式融解细胞。切勿使用手直接捂化（搓热也不行），因为手心的温度通常不够高，细胞受热不均匀且降温速度过慢，容易造成细胞死亡。
4. 水浴时没有严格控制时间，直接将冻存管放入水中静置而不摇晃，这样不利于细胞的快速融化。复苏需遵循“快融”原则，建议在2分钟内将细胞充分融化，长时间浸泡反而会降低细胞活率。理想的做法是捏住管盖，将管身快速摇晃，促进细胞融化，避免将冻存管静置在水中。
5. 若水浴结束时管内仍有较大冰块未完全融化，可能导致细胞死亡。冰块中的细胞升温缓慢会致死，同时，冰块也可能会对已融化的细胞造成低温损伤。有些同学反映2分钟内难以完全融化细胞，此时可以将水浴锅的温度提高至39度（经过尊龙凯时的实测，此方法有效），并加快摇晃速度。如果担心污染，可将冻存管放入一次性PE手套内再进行水浴。
6. 细胞融化后未进行离心以去除DMSO。有些同学会在细胞融化后直接添加10倍培养基稀释，不离心而直接培养，等细胞贴壁后再换液。尽管这一方法对于好养的贴壁细胞可行，但并非长远之计，也不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞具有一定毒性，部分细胞如HL-60细胞等对DMSO敏感。如果不确定自身细胞是否对DMSO敏感，进行离心以去除上清将更为安全。

以上内容是基于小尚多年的经验总结，结合冻存篇，旨在解决大多数复苏失败的问题。如果还有未提及的知识点，欢迎大家在评论区补充，共同提升细胞复苏的成功率，相信使用尊龙凯时的产品会使您的细胞实验更加顺利。